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高阶流式分选技巧
2019-05-02 23:46  点击数:

 

流式分选技术发展史

        经过半个世纪的不断发展进步,如今的商品化流式分选仪已经发展出不同的工作原理和使用方式。目前市场上最常见的流式分选仪是基于加电式液滴分选原理,系统通过喷嘴产生高频震荡,将连续液流断裂为独立液滴,含有目的细胞的液滴将被系统加电,并随后被分选到相应的收集管中。这其中通过区分荧光激发方式,又可以将sorter分为三类:70年代最初发展的空气激发式(jet-in-air)和90年代的石英杯激发式(cuvette),以及最新的基于微流控芯片的立体激发式分选,分别以Beckman Moflo、BD FACSAria和Sony SH800S系列为代表。

       与此同时,在流式领域中也有一些特殊应用的分选仪,如微流控分选仪和大颗粒分选仪。对于微流控分选仪而言,液流系统更加温和,因此对细胞损伤也更小,与此同时其分选速度会随着液流压力的减小而降低;对于大颗粒分选仪来说,使用空气驱使细胞样本流动,当检测到目的细胞时系统切断压力供应,可使目的细胞顺利进入收集管内,并实现100 um – 1 mm直径的细胞分选。
 对于加电式液流分选,其液流工作由流体动力学的基本原则驱动,这一现象最早由19世纪的John William Strutt Rayleigh发现。样本细胞在流动室中与鞘液汇合并被其包裹,逐个细胞稳定通过激光光斑照射并被软件收集荧光信号与散射光信号。经过液流断裂为独立液滴后,包裹有目的细胞的液滴经过系统加电后通过电极板发生偏转,最终进入到收集管中。其中,喷嘴的直径大小和液流通过喷嘴的流速决定了形成液滴的频率;在特定频率下喷嘴振幅的大小又决定了液滴断点的位置。以上条件决定了一台分选仪最终可以达到多大的分选速度以及能分选多大尺径的细胞样本。
另一个影响分选结果的重要因素是冲突事件的发生几率。从仪器硬件方面来说,当两个细胞接触极近,在通过激光照射时可能会被仪器误认为一个细胞;从分选软件方面来说,选择不同的分选模式,可获得不同的分选结果。当一个液滴中含有多个细胞时,有极大的可能导致目的细胞不符合分选条件从而被丢弃。提高每秒的液滴形成数目,可有助于解决上述问题,如slide中图片显示,Poisson于19世纪提出泊松分布规律,此规律后被发现可用于描述流式分选实验中流速、频率和分选回收率三者之间的相互关系。从中可以看出,当我们提高液滴震荡频率,可有助于提高样本回收率。

分选模式的选择

           每台分选仪都会为操作者提供不同的分选模式,以满足相应的实验需求。一般地,流式分选模式可分为三类:富集模式、纯度模式和单细胞模式。富集模式目标是捕获所有的目的细胞,即使分选液滴中存在有非目的细胞,因此yield/enrich mode可用于此类实验;纯度模式要求分选液滴中只含有目的细胞(单个或多个细胞均可),当液滴中出现其他非目的细胞时,此液滴将被丢弃,故而我们需要选择purity mode;单细胞模式要求分选液滴中有且仅有一个目的细胞,single cell mode即可提供上述功能需求,一般用于单细胞克隆建系实验。实际分选实验中,速度、纯度和得率三者之间无法同时满足,需要操作者权衡一下上述分选模式,挑选合适的分选条件。
 在分选结束后,我们需要对获得的细胞重新上样分析,确定真正的目的细胞纯度,以此来评估分选结果的纯度高低。纯度回测可在同一台仪器进行(仪器管路需要在回测前进行充分地清洗以去除残留细胞的干扰),也可另选一台仪器进行回测。回测过程中,我们可能会碰到以下两种情形:sorted population中有多少event属于非目的群体?在sorted population gate之外又有多少event出现?需要留意的是,某些荧光素可能会因为荧光淬灭现象,在回测过程中表现出荧光强度降低的结果。

分选实例讲解

       下面我们来看一组分选实验案例,通过这组分选数据详细介绍分选过程中的设门策略,目的细胞的圈定和分选后的纯度验证。大家可以从slide中看到,本组数据共展示了五张图片,plot A是散射光数据图,我们可以根据FSC和SSC两个参数,将目的细胞群体从碎片和死细胞群体中区分出来,即gate R1为目标群体。Plot B用于去除黏粘细胞,使用SSC-W和SSC-A两个参数,可显示单细胞群体(gate R2)和黏粘细胞群体。Plot C用于辨别细胞活性,通过使用细胞死活染料PacBlue来标记样本,在荧光图中可看到死细胞因为被标记上荧光染料从而显示出强的荧光信号,这一部分绝对不是我们想要的群体,因此可设门R3来选定活细胞。Plot D用于显示荧光染料PE的表达强度,选定高表达区域后可设门R4来圈定细胞。最后,Histogram E用于圈定最终的目的细胞,我们分别选定低强度区域和高强度区域,设定目标分选群体为R5和R8并开始分选。
 

 

 
        分选完成后,让我们来看一下两个群体的分选结果。首先是R5群体,从Histogram E中可看到,R5群体比例为80%,有部分细胞漂移到gate R5右侧,这可能是由分选样本中存在非R5群体细胞导致的。Plot C显示样本中几乎没有死细胞存在,但是此份回测样本没有重新经过死活染料染色,所以若想分析真实严格的活性比例,可在回测前再添加一些死活染料进行染色。同时在Plot A中,也可以看到在仍会有一些细胞出现在gate R1门外,这部分细胞可能是分选后因为损伤导致的,也有可能是管路清洗不彻底而残留下来的。
 
 
 
        接下来是R8群体的回测,数据显示回测结果与R5回测结果极为相似,由于没有继续添加死活染料染色,故而无法判断Plot C中是否还有死细胞未显示出来。Plot A显示仍有部分细胞出现于gate R1之外,可能是因为样本残留导致。最关键的数据是gate R8,其比例为80%,约有3%的events出现在gate R5中,预计是因残留出现的;余下events处于R5和R8之间,这部分细胞则是因为流式数据统计过程中的信号漂移以及荧光淬灭现象产生的。
 

 
 
 
 
 

 
 
 
以上便是分选实验的一般纯度回测过程。

衡量分选效果的指标

       根据上述分选数据我们可以得知,评估分选结果是否成功,可以参考以下三个参数:目的细胞纯度,预期目标可以设为99.9%,当然实现这一目标,需要考虑具体的分选操作、仔细设定圈门策略、添加死活染料去除死细胞干扰等众多因素;目的细胞回收率,由分选得到的events数量除以所有目标细胞数量得到,可在分选仪的操作软件中实时观察到这一参数,回收率的高低一般取决于分选模式的选择和分选条件的设定;分选速度,一般有两种表述形式,一是每秒通过激光束检测的events数量,二是每秒分选到的events数量,当使用分选速度描述实验时需要清楚是哪种形式的分选速度。
       在分选实验中还有一个关键的因素是待分选细胞的直径,这直接关系到机器使用的喷嘴的直径大小。Slide中列出了常见的一些细胞系的直径大小,左图则直观地展示了多数细胞类型和分选喷嘴的对应关系。一般地,待分选细胞的直径要小于喷嘴直径的1/5。如果喷嘴直径过小,震荡产生的液滴也将随之变小,即可能导致细胞受应激反应,或者液滴飞溅至电极板上,稍后Gardner博士会详细讨论这一现象。

分选优化策略

        SICS也叫sorter induced cell stress,即因分选过程而引起的细胞应激反应,导致细胞在分选过后细胞功能发生变化,甚至引起细胞死亡。这一现象偶尔会在分选实验中发生,并非一直存在,其主要原因一般是选用了错误直径大小的喷嘴,这可能会在分选过程中直接对细胞群体造成损伤。引起细胞应激的因素有很多,当我们将所有的因素全部排除之后,若这一情况仍然存在,此时我们该考虑使用其他的分选技术来分离目的细胞了。
 下表是常见的导致SICS现象的排除因素:使用更大直径的喷嘴,来产生更大直径的液滴;摸索分选过程中的环境温度,4℃或者室温可能对细胞状态有重要影响;更换分选收集buffer,提高buffer中serum比例,或者直接使用lysis buffer作为收集液(当需要测序时);如果分选时间很长,可以将样本分为几个小份,每次分完一份后迅速将细胞转移至培养环境中以及时恢复细胞状态。
 

样本制备的成功要素

           一个成功的分选实验,首先需要我们准备状态良好的样本。为制备良好的单细胞悬液,我们可以参考以下五点建议:添加DNAse,避免核酸物质引起的团聚;中和Trypsin,避免细胞过度消化;显微镜观察细胞,确保没有明显可见的团块与死细胞;滤膜过滤,以及上样前保证样本充分混匀。同时,对于高浓度的细胞样本,我们需要稀释样本以避免形成团块,降低冲突事件的发生几率;而对于低浓度的细胞样本,分选速度过低会延长分选时间,导致死细胞增多,提高上样速度后又可能降低分辨率。上述两个条件最终会影响分选结果的回收率,故而我们需要平衡这两者,选择一个合适的样本浓度,这可以根据所分选的细胞种类来调整。

分选前的仪器设置

       样本准备完毕后,我们需要设置正确的仪器条件,以执行分选程序。分选和分析极为相似,但分选要求更为严格。我们必须调整合适的电压条件,以获得最佳的信噪比;同时记录单染样本和FMO样本,计算补偿矩阵,以便设置最精确的gate。在正式分选之前,仪器设置这一步可能会耗费我们半个小时甚至一个小时,此时样本细胞极有可能会重新沉淀聚集,我们需要在分选前对样本再次过滤,以确保严格的单细胞悬液状态。

Tube分选校正

           对于tube分选,在分选之前,我们还需确认侧液流的轨迹与落点。在Sony的分选仪上,这一步将由软件自动完成,所以我们不用太费精力。而在其他的分选系统上,我们仍需手动调整侧液流的偏转方向。此时,我们需要留意侧液流的偏转角度和收集管的倾斜角度是否一致,当两者不一致时千万不能调整液滴偏转至tube中间,因为这极有可能会导致液滴落在tube侧壁上;同时我们还需要控制tube中收集液体积,确保液滴可以被接收到;某些情况下,一侧的tube收集的细胞很多,当tube中液体很多时,液滴落下可能会造成一些飞溅,污染到另一侧的tube,因此及时使用splatter shield也很重要。

孔板分选校正

           对于孔板分选,我们同样需要确认液滴的落点处于孔板的孔中间。建议使用角度适配器调整孔板接收角度,以便液滴垂直落入孔中;如果条件允许,也可将非目的细胞加电偏转,使目的细胞垂直进入收集孔板。分选之前,我们可以在板盖上进行液滴打点,约30-50个液滴足以分辨打点位置。若使用单细胞分选模式,还可以使用HRP显色原理,确认孔板分选精确度(具体操作方法可参考链接https://www.well.ox.ac.uk/ogc/a-colorimetric-method-to-determine-efficiency-of-facs-sorting/)。

分选过程中的参数监控

       在分选过程中,我们需要对仪器的运行参数定时进行了解,以确保仪器稳定运行,以下7个参数可以帮助我们掌握仪器运行状态。首先是液滴断点和液流稳定性,Sony分选仪可以智能化自行判断,帮我们节省很多精力;其次是收集液体积,我们需要预估分选需要的液滴体积,确保最后的收集液不会溢出;分选速度,一般由液滴频率决定,建议控制在频率的1/4以下;上样速度实时变化,可以用于预测液流压力变化和上样管路是否通畅;回收率,了解分选过程中丢弃的细胞数量;散点图细胞群体的位置变化,可以反映液流是否稳定以及上样速度是否过快。
当分选开始后,我们需要预估其持续时间,这一般取决于两个因素:上样速度和目的细胞比例。如slide表格所示,在20000 eps的上样速度下,不同的细胞比例,其分选耗费的时间也不相同。并且,由于冲突事件发生的可能性,我们需要在原来计算的分选时间的基础上,再额外加上约50%的时间。

分选结果评估

           当分选结束后,我们需要安排收集管回测以验证分选结果。结果回测常用的检测参数为纯度,用于评估收集管中混杂了多少非目的细胞。然而我们需要了解的是,纯度并不是最理想的回测指标。有时候回测纯度很低,但仪器实际分选表现很好,低纯度可能是因为分选后细胞状态的变化引起;还有些时候回测纯度很高,但仪器分选表现其实并不理想,因为我们可以通过稀释样本来提高分选纯度,这种情况下仪器性能会首先影响回收率,而非纯度。
       我们实验室在分选方面做了大量工作,过去的分选经验告诉我们相比于纯度,回收率其实是更好的回测评价指标。在下面这张slide中,我们将使用Rmax来描述仪器分选过程中的最大回收率。左侧的样本是两群beads,分选完成后回测,可以看到APC gate共有1001 events,同时FITC gate中出现了47 events,因此实际的最大回收率Rmax为95.3%。Rmax可以更好地反映出在非目的细胞群体中,有多少events是因为仪器的错误分选而产生的。
 
      分享完高阶流式分选技巧,最后为大家介绍Sony最新款的智能型多功能自动化分选平台MA900
多功能自动化分选平台MA900具有基于微流控芯片技术的高度自动化校准功能,可以实现12色检测和4路分选,以及96/384孔板分选等强大功能,让分选实验更加简单。同时,也有个人型自动化分选仪SH800S,同样是基于微流控芯片技术,可以实现高度智能的自动化校准工作,具有6色检测(6 channels + 2 scatters),2路分选和孔板分选功能。若各位想继续了解我们的产品,请访问www.fortunatt..com网站查看更多产品信息

 

 
 


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